细菌16S rRNA基因序列是集高度保守和变异性与一身的，现在采用的多数PCR扩增引物都是采用的所有细菌的通用引物，即：几乎能够扩增出所有的真细菌。所以，16S rDNA的扩增面临的主要问题是污染，只要有其他细菌DNA的污染，就可能出现假阳性或测序重叠峰，也就是说一条1500bp的带可能是多个细菌的16s rDNA的扩增产物的混合物。
解决这一问题需要注意的事项很多：
1.所有的物品和试剂都要严格防污染，包括taq酶，有很多公司产的聚合酶是用细菌生产的，如果处理纯化不当可能含有细菌的DNA；
2.扩增模板开始时一定要选取单个菌落来制备；
3.由于该基因在多数细菌基因组内是多拷贝的，所以模板DNA的量不宜太多，否则有非特异性扩增（你的带看上去模板DNA就有些过量）
4.测序宜采用连接T载体后进行，不宜采用PCR产物直接测序的方法。
5.每次PCR都要设立未加模板的空白对照！
6.照片中引物二聚体也很多，需适当减少反应体系中引物的用量。追问
解决这一问题需要注意的事项很多：
1.所有的物品和试剂都要严格防污染，包括taq酶，有很多公司产的聚合酶是用细菌生产的，如果处理纯化不当可能含有细菌的DNA；
2.扩增模板开始时一定要选取单个菌落来制备；
3.由于该基因在多数细菌基因组内是多拷贝的，所以模板DNA的量不宜太多，否则有非特异性扩增（你的带看上去模板DNA就有些过量）
4.测序宜采用连接T载体后进行，不宜采用PCR产物直接测序的方法。
5.每次PCR都要设立未加模板的空白对照！
6.照片中引物二聚体也很多，需适当减少反应体系中引物的用量。追问
"yanzhiyong2001"，你好！按照你的建议，我将模板量和引物量减少了，但条带上面还是有云雾状条带。而且可以确定DNA模板不存在污染现象，请帮忙分析下那些云雾状条带是什么，该怎么解决？
我的解释：延伸时间过长（我延伸设定的时间是1分45秒）
我看了你的带，引物二聚体已经没有了。你的阴性对照结果如何？
带的问题不是太大，因为你的marker也有涂布现象，所以问题可能不完全是PCR的，你先跑个电泳，把上样量减少，估计中间的2个泳道就会十分sharp，最右边的你上样0.5-1微升看看。
再就是还可以在提高一下复性温度，延伸时间1500bp的可用1-1.5min。
温馨提示：内容为网友见解，仅供参考
第1个回答 2012-05-13
估计细菌不是单一菌株吧？如果不是单一菌株，提高点退火温度，扩出不弥散的条带，割胶纯化后做克隆，挑10至20个测序。如果是单一菌株就只提高退火温度就好了。
第2个回答 2012-05-14
1、Smear是非特异扩增的结果。割胶回收回来就好。
2、测序出现非特异：说明你的原始菌体不单一，建议做个克隆后挑几个斑测序。
2、测序出现非特异：说明你的原始菌体不单一，建议做个克隆后挑几个斑测序。
第3个回答 2013-11-21
1、Smear是非特异扩增的结果。割胶回收回来就好。
2、测序出现非特异：说明你的原始菌体不单一，建议做个克隆后挑几个斑测序。
2、测序出现非特异：说明你的原始菌体不单一，建议做个克隆后挑几个斑测序。
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