我的目的蛋白酶大小为35kDa和32kDa,其他杂蛋白均大于45kDa,我应该怎么纯化出目的蛋白?

我的目的蛋白酶大小为35kDa和32kDa,其他杂蛋白均大于45kDa,我应该怎么纯化出目的蛋白?
是在毕赤酵母中表达的，该蛋白酶预测等电点是6.3

是原核？还是酵母？还是其他表达方式？
把样品情况多说点会更好。

你的目标蛋白
个人建议2套方案：
1，亲和层析：查询文献，有无针对这个酶的亲和层析方案或填料，如果没有，就别自己折腾了，太复杂；
若是有标签，那就直接上标签特异性的亲和了，如His-tag、GST-tag等；

2，离子交换：若无标签，可考虑离子交换，这需要优化条件，而且估计需要2步离子交换；

初步的纯化完成后，如果纯度还达不到你的要求，再根据残留的杂蛋白的分子量大小考虑分子筛分离（一般分子量差异在2倍以上才能高效分离）。

欢迎继续讨论，祝愉快！追问

我是在毕赤酵母中表达的，这个蛋白酶预测等电点是6.3；我都已经表达出来了，是没有标签的。
因此可能只能用离子交换了，问下如果用离子交换我应该具体怎么操作？要用什么柱子？缓冲液体系用什么？

追答

6.3的等电点，蛋白偏酸，你可以先试试阴离子交换层析，因为可以采用相对温和，pH在8.0左右的缓冲液，缓冲液的类型依赖于你的酶在哪种缓冲体系中最稳定，PBS可能是最常用的。

柱子，因为是初步纯化，分辨率不必太高，用GE公司的HiTrap FF系列就够了，价格便宜，流速快，至于只强阴离子Q，还是若阴离子DEAE，这就要试过才知道，若想更经济，就买对应的GE填料，自己去装柱。

做完初纯，如果纯度达不到你的要求，可以考虑再用高分辨率的Hitrap capto Q（或更高分辨率的Mono Q，贵）系列柱子；或者换做阳离子交换，用hitrap capto S，但这需要换用pH 5.0左右的缓冲液，就看你的酶能否稳定。

此外，需要提醒的是，这个预测的等电点可能不准，因为酵母中是有糖基化和其他修饰的，

温馨提示：内容为网友见解，仅供参考

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