10ul
4种dNTP混合物
各200umol/L
引物
各10～100pmol
模板DNA
0.2ug
Taq
DNA聚合酶
2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
加双或三蒸水至
100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键,PCR
产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右.②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段.③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带.⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败.⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处.⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性
希望有所帮助
再以cdna为模板进行pcr扩增，而获得目的基因或检测基因表达。rt-pcr使rna检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量rna样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cdna探针、构建rna高效转录系统。
rt-
pcr即逆转录pcr，是将rna的逆转录（rt）和cdna的聚合酶链式扩增反应（pcr）相结合的技术。rt-pcr技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列等。
简述建立pcr反应体系时需注意哪些问题
应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败.⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处.⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性
pcr反应体系包括哪几个组分
(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。(3) G\/C 和A\/T 碱基均匀分布，G\/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互补...
建设PCR实验室时需要注意什么?
建设PCR实验室时，选择合适的位置至关重要。实验室应位于空气流通、光线充足、无污染源的区域，以确保PCR反应体系不受污染。实验室尺寸需足够大，以便容纳PCR反应仪器、试剂和工作区域等所有必需设备。设计方面，推荐采用单向流动设计，有效避免污染交叉，确保实验结果的准确性。装修材料需易清洁且无菌化，如...
PCR实验过程中的注意事项有哪些呢?
其次，实验过程中操作的规范性同样重要。从样本制备到扩增反应的各个环节，应严格遵守无菌操作原则，防止外界污染。同时，注意PCR试剂的储存条件和有效期，确保其活性，避免因试剂问题影响实验结果。第三，反应体系的优化对PCR实验至关重要。包括PCR引物的设计、反应缓冲液的配制、DNA聚合酶的使用等。合理设计...
在做pcr的操作过程中需注意哪些问题?
首先，在设计PCR引物时，结构要好，长度应在20bp左右，避免引物间形成引物二聚体。两条引物的退火温度尽量保持一致，最好是在55度左右。其次，使用的DNA模板量是比较关键的，应使用纯度较高，基因组较完全，没有产生断链的基因组DNA。然后是PCR体系中各个试剂的使用，比如说酶的纯度，活性，并且要注意...
做q-PCR需要注意哪些方面?
1、成败的关键在引物，所以引物设计要特异性好，如果是Taqman法，探针设计要特异性好，可以尝试文献报道的序列；2、模板是基础，抽提的mRNA要注意保存，添加RNase抑制剂，尽快转录成cDNA，在-80度保存；3、加样的时候注意更换枪头，避免交叉污染；4、有时需要预混后分别加入8联排管，需要考虑沾壁的损失...
pcr反应体系包括哪几个组分
分子生物学实验中PCR各组分的作用类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性，模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下...
规范化的pcr实验室应注意哪些
2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。3、建立前PCR区。该去专门用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR...
PCR实验最常见的9个问题及解决方案
PCR实验中常见的问题及解决方案 设计引物时，使用Oligo或Primer工具，确保在保守区域设计，长度控制在18-27bp，上下游引物的Tm值范围为60-75℃，GC含量40%-60%，避免引物自身及引物之间的互补序列，以防止发夹结构的产生。若PCR电泳无扩增条带，可能原因为酶失活、模板含有杂质、变性温度不准确、反应体...
PCR混合体系建立的问题
其间注意保持酶的活性，所以酶在最后加入，也就是你先加模板，在加mix里的其他东西，最后加酶混匀后再分别加到加有模板的pcr小管里。加了酶之后最好不要使用剧烈的vortex，用手指轻弹混匀。配mix时记得多算量，比如你连模板带对照是6管，一般配6.5或者7倍用量的mix，防止挂壁等问题使最后加的量不...
