RNA提取的疑问,求助

如题所述

RNA提取步骤及注意事项(仅供参考):

实验步骤如下:

1.取50—100mg的组织,加入1ml Trizol试剂,用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)。

2.将匀浆室温放置5min。

3.加入200μl氯仿,剧烈震荡混匀30s,冰上静置3min。

4.12000rpm,4℃离心15min。

5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中(取400μl),加入等量体积的异丙醇,上下颠倒几次混匀,室温下放置15min。(此步中注意:不要吸取任何中间层物质,宁缺勿烂。)

6.12000rpm,4℃离心15min。

7.小心移去上清液,防止RNA沉淀丢失。

8.用70%乙醇(DEPC处理的水配制)洗涤1次,加入700μl乙醇,将RNA沉淀弹起,漂洗。(此时RNA是不溶解的)

9.8000rpm,室温离心10min。

10.尽可能彻底地吸走上清,防止RNA沉淀丢失。

11.真空离心干燥3—5分钟,或放在室温下使乙醇完全挥发掉。

12.沉淀用30μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶,68℃处理10min。

13.RNA检测

(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/ml RNA计算RNA的产量。

OD260/OD280在1.8-2.0。

(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。

注意事项:

1.获得RNA效率低有一下原因

a:样品裂解或匀浆处理不彻底

b:最后得到地RNA沉淀未完全溶解

2.A260/A280<1.65原因

a:检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下,A280值会较高

b:样品匀浆时加地试剂量太少

c:匀浆后样品未在室温放置2分钟

d:水相中混有有机相

e:最后得到地RNA沉淀未完全溶解

3.RNA降解原因

a:组织取出后没有马上处理或冷冻

b:样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度,未在-60--70度保存

c:细胞在胰酶处理时被破坏

d:溶液或离心管未经RBase去处理

温馨提示:内容为网友见解,仅供参考
第1个回答  2018-04-25
我只做过液氮研磨,不太清楚你们的细胞研磨器是啥...是匀浆器?按照他给的protocol的做法是先称10mg样品,放到1.5mL ep里,再加500mL LY,再匀浆,充分混合后取上清(他没说,但我觉得可以离心),然后上DNA柱。LY中要加入beta巯基乙醇,抑制RNase,否则RNA极易降解。
我们做液氮研磨则是先取样品,研磨,研磨成粉之后称取合适的质量,然后加裂解液,充分混合后离心取上清。你看你们那里的条件选择合适的做法吧。本回答被网友采纳

RNA提取原理
Trizol是一种总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速裂解细胞,抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中,Trizol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相...

手把手教学——RNA提取的实验步骤&注意事项
注意氯仿可能带来的DNA污染,确保溶液充分混合,RNA位于上层水相。小心转移水相,取约600μL,用异丙醇沉淀RNA,确保混匀,必要时加糖原增强纯度。离心后丢弃上清,彻底去除液体,用乙醇清洗并干燥或真空干燥RNA。避免加热,低温溶解RNA,如需加热,控制在40°C。FreeZol法与TRIzol类似,先混匀匀浆,离心后...

rna提取时哪一步是去除DNA的
经典的TRNzol法中有一步是加DNase的。这就是除DNA的一步。CTAB法中是加入LiCl这一步除去的DNA。氯化锂可以选择性沉淀RNA。如果你对这个答案有什么疑问,请追问,另外如果你觉得我的回答对你有所帮助,请千万别忘记采纳哟!

植物RNA的提取用根好还是叶比较好?
你好!这个要看你提取RNA的目的。一般来说,用叶子比较好。但是对于某种在根中特异表达的基因,你就只能用根了。如有疑问,请追问。

提取昆虫RNA有哪些方法?
惜取上清液如EB管,加入等体积异丙醇,充分混匀,静置10min;离心15000r\/min 4摄氏度 10min 4.弃上清液,加冰冷的75%酒精 洗涤2次,每次离心8000r\/min 4摄氏度 10min 5、静置 4分钟 干燥后 加入RNA-FREE 水 我刚做完这个实验 试验成功 电泳很清晰 这是我的实验步骤 如有疑问可以问我 ...

求帮翻译下!期末考试的!谢谢了!
而不是一个南方印迹当RNA是invdved许多实验过程涉及RNA依赖于第一个把RNA和DNA这个过程叫做反转录 我告诉你一个方法,你可以把每一句划意群,每个意群用特殊疑问词代替.祝你学习进步,更上一层楼!(*^__^*)

RNA的碱基组成中没有T吗
答案是yes。另外我告诉你一个方法,RNA是单链,含U不含T;DNA是双链,含T不含U,所以做人要做一条RNA,即便一直单着,也能一直拥有U(外语you,你的意思)。

rna有双链
形成局部双链RNA。双链RNA对于动物、植物和病毒还存在调控基因表达的作用。来源于植物的局部双链RNA会被dicer酶切割成21bp左右的miRNA,调控植物的基因表达。来源病毒的双链RNA也会被Dicer酶切割成21bp左右的siRNA,会沉默寄住基因的表达。如果还有什么疑问,可以联系我。本人主要从事病毒的研究 ...

生物RNA干扰技术服务主要包括哪些内容?
生物RNA干扰技术服务主要围绕RNA干扰(RNAi)机制,提供基因沉默解决方案。这项服务包含多个关键步骤:设计与合成siRNA或shRNA分子、构建表达载体、实施细胞转染或病毒包装,以及评估基因沉默效果。其目的是帮助科研工作者进行特定基因的功能研究与药物开发。我们赫贝致力于为客户提供优质服务,满足客户的需求。如...

关于DNA与RNA的小疑问~
有很多病毒都是只有RNA作为遗传物质的,比如艾滋病毒、SARS 病毒等等。

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