高二生物基因工程方面的一点疑惑。求解答！

1、在筛选重组细胞之前不是已经完成了DNA重组导入了目的基因吗，为什么在此处还有插入目的基因一说？是再次插入还是一开始目的基因就插在了含有抗性基因的部分？抗性标记基因和目的基因插入位点难道可以重合吗？
2、四环素抗性基因被插入目的基因失活后，为什么会无菌落？失去抗性不是应该生长出菌落吗？难道四环素抗性基因并非抵抗四环素菌落生长反而是促进作用？

1、在筛选重组细胞之前不是已经完成了DNA重组导入了目的基因吗，为什么在此处还有插入目的基因一说？是再次插入还是一开始目的基因就插在了含有抗性基因的部分？抗性标记基因和目的基因插入位点难道可以重合吗？

---不是再插入，而是一开始就是插入到载体，然后转染细菌的。目的基因插入位点在这个例子里就是位于抗四环素基因中间的。

2、四环素抗性基因被插入目的基因失活后，为什么会无菌落？失去抗性不是应该生长出菌落吗？难道四环素抗性基因并非抵抗四环素菌落生长反而是促进作用？

---这个四环素抗性基因编码的是可以降解灭活四环素的酶。如果该基因完整，则被转染的细菌再含四环素的培养盘上可以存活。如果目的基因插入到四环素抗性基因中间，这个酶的表达被破坏，那该细菌就不再能抵抗四环素的杀菌作用，所以就不能形成菌落了。

这个教科书举的例子很不好，实际上根本就不用这个方法来筛选的。实际的方法叫做蓝白筛选。质粒上有一个抗生素抗药基因，保证只要转入质粒的细菌都能存活。在目的基因插入点的位置，是编码一个酶，叫做β-gal。这个酶可以降解底物形成蓝色物质。如果有目的基因插入，这个酶就不能表达。

在培养盘上涂有相应的抗生素和该酶的底物。把转染后的细菌涂盘。没有质粒转染的细菌都被杀死，不能形成菌斑。那些转染了没有目的基因插入质粒的细菌，虽然能存活，但是由于酶的表达，形成的菌斑是蓝色的。只有那些白色的菌斑才是带有目的基因插入质粒的。

一部就可以完成了。

所以你这个教科书要改一改了。追问

很详细很清楚哈 先谢过了 不好意思 还有个问题 既然筛选重组细胞时一般会用到抗性基因 那么目的基因插入位点是不是一般也在抗性基因那一部分之内呢（书上的图两部分是分开画的 很疑惑）？

追答

不是的。基因的插入位点是结果设计的。插入后会改变质粒表达的性状。这个和所谓的抗性基因是不一样的。你教科书上的这个例子，两个基因都用了抗性基因，所以容易引起混淆。

原理是：质粒上至少要有一个抗性基因，这样细菌被转染后可以先存活下来。而其他大部分没有被转染的细菌就被杀灭了。这个抗性基因和目的基因的插入点是不相干的。

然后就是目的基因的插入点，可以是另外一个抗性基因，也可以是我说的酶，只要一有序列插入，原来这个位置上的基因表达被破坏，可以导致细菌的性状发生改变就可以。

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