通过克隆甘露聚糖酶基因到pMD-18T载体构建了质粒pMD-18Tman2XcmI,克隆的甘露聚糖酶基因两侧各引进了一个特定的XcmI 酶切位点;用XcmI酶切质粒pMD-18Tman2XcmI可以制备T载体.因为甘露聚糖酶基因作为填充片段和筛选标记受半乳糖苷酶基因启动子的控制,甘露聚糖酶能够表达,从而水解甘露聚糖产生水解圈,指示转化了部分酶切质粒的背景菌落.此外,在甘露聚糖酶基因中存在第3个不同序列的XcmI酶切位点,因此残余的甘露聚糖酶基因引起的背景可以进一步降低.抽提大量质粒贮存,随时制备T载体使用,增加了克隆的稳定性.该T载体克服了一般T载体质量不稳定,费钱,克隆效率低,假阳性高的缺点.使用构建的T载体完成了10个基因的克隆,结果表明重组效率达到了90％～100％.
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第1个回答 2020-07-21
应该是分子克隆用的载体，使用前是双链线性片段，上面有必要的测序或表达元件，两头是黏末端，各在3'有一个游离的t（故名t载体）。因为pcr实验中用的聚合酶大部分都是taq和taq的同类酶，会在pcr产物的3'末端自动加一个a，这样pcr产物纯化之后无需酶切就可以与t载体连接，连接结果为带有目的片段的环状质粒载体。之后转化挑克隆，进行表达和测序。
第2个回答 2007-07-16
1)JM109, DH5 alpha, 等都是可以的,并没有特别的要求.
2)Amp+(或其他抗性), 在筛选的各个步骤都是不可缺少的,参考分子克隆实验指南的开始部分.念书的时候,微生物课老师让我们把涂培养基的培养皿打开盖子后吹一口气,培养一夜后,第二天再看, 培养基表面跟俺穿了个把月没洗的袜子一样.
3) 蓝白筛选,是用于阳性克隆的筛选,要知道以前的所谓"影印"法是靠双抗性的载体进行筛选的;而蓝白筛选是后来发展出来的一种直接挑选方法,也就是说, 理论上讲白的就是阳性,而蓝的是阴性.
4)不同公司的T载体制作方法有所不同. 所谓T载体自连是指: T-vector的纯度不会是100%(制造方法决定), 所以没有加上T的分子,或未加T前的载体分子的残留,都可能造成自连.实际上可能还有其他可能.
5)实际上带lacZ的,或者说用蓝白筛选的T载体的使用, 阳性克隆获得时蓝白筛选的应用是
第二位的:首先, 无插入的克隆相对而言少的多(包括非特异片段诸如引物二聚体的插入;自连但LacZ的表达框架改变;自连且lacZ表达的, 等等). 其次,菌落中白色菌落要多,其中有插入片段者有占有大部分.
6)如果T-vector的纯度是100%, (甚至有的方法是加上ddT), 就不会有自连; 那么,所有克隆都是阳性克隆(未必一定是蓝色或白色). 这就是为什么说蓝白筛选对TA克隆来说, 怎么说呢,粗俗点讲象是所谓short-gun marriage, 或是象俗语"打那儿指那儿"所意味的那样---"不是第一位的".
您问的其实是个很重要的问题, 但未必有多少人认真思考过.
2)Amp+(或其他抗性), 在筛选的各个步骤都是不可缺少的,参考分子克隆实验指南的开始部分.念书的时候,微生物课老师让我们把涂培养基的培养皿打开盖子后吹一口气,培养一夜后,第二天再看, 培养基表面跟俺穿了个把月没洗的袜子一样.
3) 蓝白筛选,是用于阳性克隆的筛选,要知道以前的所谓"影印"法是靠双抗性的载体进行筛选的;而蓝白筛选是后来发展出来的一种直接挑选方法,也就是说, 理论上讲白的就是阳性,而蓝的是阴性.
4)不同公司的T载体制作方法有所不同. 所谓T载体自连是指: T-vector的纯度不会是100%(制造方法决定), 所以没有加上T的分子,或未加T前的载体分子的残留,都可能造成自连.实际上可能还有其他可能.
5)实际上带lacZ的,或者说用蓝白筛选的T载体的使用, 阳性克隆获得时蓝白筛选的应用是
第二位的:首先, 无插入的克隆相对而言少的多(包括非特异片段诸如引物二聚体的插入;自连但LacZ的表达框架改变;自连且lacZ表达的, 等等). 其次,菌落中白色菌落要多,其中有插入片段者有占有大部分.
6)如果T-vector的纯度是100%, (甚至有的方法是加上ddT), 就不会有自连; 那么,所有克隆都是阳性克隆(未必一定是蓝色或白色). 这就是为什么说蓝白筛选对TA克隆来说, 怎么说呢,粗俗点讲象是所谓short-gun marriage, 或是象俗语"打那儿指那儿"所意味的那样---"不是第一位的".
您问的其实是个很重要的问题, 但未必有多少人认真思考过.
第3个回答 2007-07-16
一种才体方式
第4个回答 2007-07-16
一楼的霸道
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